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几种生物特征识别技术在食品有害小分子物质快

2019-06-18 10:25      点击:

几种生物特征识别技术在食品有害小分子物质快捷检测中的应用

江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.),2013,29(1):209~215王耘,刘贤进,刘媛,等.几种生物特征识别技术在食品有害小分子物质快捷检测中的应用[J].江苏农业学报,2013,29(1):209-215.doi:10.3969/j.issn.1000-4440.2013.01.036几种生物特征识别技术在食品有害小分子物质快捷检测中的应用王耘1,一,刘贤进1,刘媛1,张存政1,谢雅晶1,白红武1(1.江苏省食品质量安详重点尝试室——省部共建国家重点尝试室培育基地,农业部农产品质量安详控制技术与规范重点尝试室,江苏南京210014;2.南京农业大学植物护卫学院,江苏南京210095)摘要:食物中有毒有害小分子的检测方法不停是食品安详的钻研热点。仪器法检测老本高、耗时长。为了促进开发新型的快捷检测技术,该文介绍了单链凯时娱乐网址登录抗体、核酸适体和抗运载蛋白为代表的3种生物特征识别资料,比较了各检测体系的特异性、灵活度、不变性及实用性,并在其应用钻研停顿的根底上,对此后的钻研标的目的停止了展望,以期推进食品安详快捷检测技术的开展。关键词:生物特征识别资料;小分子;快捷检测中图分类号:Q789;S1文献标识码:A文章编号:1000-4440(2013)01-0209-07Application●of●biometricelementsinJ●』■determinationoflowmolecularweil乏latcontaminantSl??1lntDOdWANGYunl”,LIUXian-jinl,LIUYuanl,ZHANGCun—zhen91,XIEYa-jin91,BAIHong.WUl(1.KeyLaboratoryofFoodQualityandSafetyofJiangsuProvince/StateKeyLaboratoryBreedingBase/KeyLaboratoryofControlTechnologyandStandard.加rAgro-prodnctSafetyandQuality,MinistryofAgriculture,NanjingNanjing210095,China)210014,China;2.CollegeofPlantProtection,NanjingAgriculturalUniversity,Abstract:isessentialtoAsensitivemonitoringofcontaminantsinfood,suchaschemicalpollution,antibiotics,pesticide,toxin,ex-assessandavoidrisksforhumanandenvironmentalhealth.Theinstrument-baseddetectionmethods,forample,chromatography,arehigh-costandtime—consuming.Fordeterminationofsmallmoleculecontaminants,therapiddetectionmethodhadbeenresearched,basedploying.Recentlyaonimmunologyandmolecularbiologytechnologywithbiometricelementsem-tolotofresearchefforthasbeendedicatedthedevelopmentofnovelrecognitionelementswithexcep—tionalcharacteristics,suchashighaffinityandspecificityfortheirtargets,beingfast,cheapandanimal—friendlyproductionavoidingbatchtobatchvariations,beingstableandeasytobemodified.Thisreviewdiscussedthreeoftheseinnovativeaf-finity—basedrecognitionelements,namely,scFv,aptamerandanticalin,andgaveanoverviewofapplicationsforfoodcon一taminants收稿日期:2012-06-08基金项目:“973”方案项目(2012CB722505);国家自然科学基金项目(30871658);江苏省农业自主创新项目[CX(10)237];农业部“948”项目(201l—Z46)作者简介:王耘(1985-),女,江苏南京人,博士钻研生,钻研标的目的为食品安详快捷生物检测技术。(Tel)025-84390401;(E—mail)yuebaiheapple@sina.comanddetection.Thespecificity,sensitivity,stabilitybasedonapplicabilityofmethodasthesebiometricelementswerecomparedentationtectionwell.Thefutureresearchori—w髂prospectedtopromotethesafeandrapidde—oflOWmolecularweightcontaminantsinfood.biometricelement;smallmolecule;Keywords:rapiddetection通讯作者:刘贤进,(Tel)025-84390396;(E-mail)jaasliu@jaas.ac.cn食物中有毒有害小分子物质(包含农药、兽药万方数据2lO江苏农业学报2013年第29卷第1期和抗生素残留、重金属富集、生物毒素等)是引起食源性疾病的主要因素…,对这类物质建设快捷高效的检测方法不停是食品安详钻研中的热点问题。目前,对小分子物质的检测有免疫试剂盒旧。J、拉曼光谱H1、液质/气质联用¨1等方法,但是现阶段制备免疫试剂盒中的抗体仍必要免疫动物,制备步伐繁琐且工夫长;仪器法必要昂贵的办法和复杂的前办理技术与之配套,应用老本大,故都不能满足大批量快捷检测的要求。式归-。抗体是一种在生物体内能特异性识别非本身物质的生物大分子,其识别才华高,被定义为传统的生物特征识别资料…。但是制备传统的抗体必要免疫动物,试验工夫长且差异个体间存在差别。基于以上局限性,20世纪开展起来的抗体库、核酸适体、配体联结蛋白等技术在很洪流平上推进了生物特征识别资料的可操作性。1.1单链抗体单链抗体(Singlechainantibodyfragment,scFv)检测是在通例免疫技术根底上开展起来的一项新方法,它是抗体识别并联结抗原的最小构造域,分子量仅为28000—30基于分子生物学技术开展起来的以生物特征识别资料为根底的快捷检测方法,为特异性识别与检测食物中小分子污染物提供了便利的技术平台。它不只识别才华强、制备简略、老本低…,还能宽泛应用于多种检测技术、疾病诊断及药物的开发钻研∞’7J。本文介绍3种生物特征识别资料,即单链抗体、核酸适体和抗运载蛋白,及其在小分子检测中的应用悼1。增强对生物特识别资料的钻研,将进一步促进快捷检测技术在食品安详领域中的应用和开展。000,通过一个小多肽将重链和轻链可变区拼接¨叫(图1),既生存了抗体的识别功能,又因分子量小而按捺了完好抗体分子制备和应用时的弊端…1。抗体库的主要技术流程是从免疫或非免疫的外周血或小鼠的脾淋巴细胞中提取mRNA,逆转录成cDNA,通过PCR别离扩增抗体可变区的重链(V。)和轻链(V。.)基因,通过短肽连贯,以噬菌体为载体,构建文库,抗体库与靶标物质联结后洗涤去除非特异性联结,而特异性洗脱的噬菌体抗体传染宿主菌后被扩增富集¨厶14J,经过多轮“吸附一洗脱一扩增”的淘选过程取得高亲和力的单链抗体。由于文库中轻链和重链的随机化,使其库容量能到达108~10m【9J,可以满足多种靶标物质的联结。1生物特征识别资料的原理与制备技术生物特征识别资料是基于生物分子间的互相联结作用开展起来的有识别才华的多种生物分子。除了与待测物质通过离子键、氢键、疏水键等非共价键联结,分子识别过程中外形互补是最重要的联结方嚣姗图1单链抗体的构造Fig.1Structureofsinglechainantibodyfragment万方数据王耘等:几种生物特征识别技术在食品有害小分子物质快捷检测中的应用2111.2核酸适体SELEX的根本原理是在体外人工合成一个库容为1013~10”的寡核苷酸文库,与靶标物质孵育后,联结PCR扩增,指数级富集与靶标物质特异联结的寡核苷酸,经过几轮或数十轮体外“挑选一扩增一富集”过程,取得高亲和力、高特异性的核酸适体Ⅲ埘J。依据靶标物质的差异,近年来,一系列SELEX技术的改进方法一直涌现旧引,例如毛细管电泳、加尾、变构法、消减、切换、表达盒SELEX等嵋3|。核酸适体(Aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexpo-nentialenrichment,SELEX)从寡核苷酸库中挑选出来的一段RNA或ssDNA¨5|。它特异性地与靶标物质联结时常造成一些不变的构造,如发夹、茎一环、G-四聚体、假节、鼓包等¨昏181(图2),其间的互相作用力包含“假碱基对”的沉积作用、氢键作用、静电作用和外形匹配等¨引。G一四联体鼓包复合构造—o目假结.r.r....r..r..r..r...r..'.、.....T-连贯图2核酸适体构造Fig.2Structureofaptamer1.3抗运载蛋白脂质运载蛋白为骨架构建文库,在B桶状构造的开放端和B转角的链接处设想16个突变位点,并操作PCR技术实现库的多样性,使其库容量可到达108~1011,并联结噬菌体展示技术停止挑选Ⅲ1,取得能特异联结靶标物质的抗运载蛋白分子。抗运载蛋白(Anticalin)是以脂质运载蛋白(Li—pocalin)为骨架蛋白,操作随机突变肽库技术制备的具有相似抗体功能的特异性识别分子旧J。脂质运载蛋白是一类含有160~180个氨基酸残基的小分子蛋白质家族,其典型的生物学功能是运输储存低溶解度物质和化学敏感性物质,如维生素、类固醇类激素、芳香素、信息素和多种二级代谢产物。其三级构造的保守核心局部是8个反向平行的p转角造成的p桶状构造,N端处的p折叠区与卷曲的多肽局部相连,c端的B折叠与Or.螺旋相连,底部由横贯桶底的多肽片段封闭,另一端开放局部连贯了4个以回文模式相连的环区构造,环区与开放式构造独特造成了疏水配体分子进入桶穴内的入口通道Ⅲo(图3)。4个环区构造是高度变异的,其高级构造特征与抗体相似,正是由于环区的高度变异性决定了脂质运载蛋白分子的特异性联结∞o,当有靶标物质呈现时多肽链伸展,并互相挨近,使靶标物质插入联结∞J。基于脂质运载蛋白构造不变且可以在细菌的原核表达系统中大量表达的特性,人们以A~H为8个反向平行的p转角彤成的B桶状构造,并标示出4个环区构造。图3脂质运载蛋白构造Fig.3StructureofUpocaLin万方数据江苏农业学报2013年第29卷第1期2生物特征识别资料的应用与特点2.1生物特征识别资料的高亲和力和高灵活度2.1.1单链抗体孙宪连操作噬菌体展示技术胜利制备了抗黄曲霉毒素B1的scFv,在小鼠脾细胞中提取RNA,体外扩增出抗体重链可变区和轻链可变区基因,并克隆进入噬菌粒表达载体pCANT.AB5E中,构建scFv文库,以此挑选出抗黄曲霉毒素B1的scFv旧7。。Daly等操作SPR检测技术,使其检测限到达3斗g/L。28I。噬菌体抗体库中挑选到能联结克伦特罗(瘦肉精)的scFv,/C,。仅为其单克隆抗体的1/2E29。。本课题组从TomlinsonJ抗体库中挑选到伊维菌素(IVM)的scFv,其圯铀为4.11mg/L旧0|。而Wang等克隆出的高亲和力的抗卡巴呋喃的scFv与其他氨基甲酸酯类农药不只没有穿插反馈,且,c50到达1¨g/L¨“。2.1.2核酸适体本课题组挑选出的针对啶虫咪的核酸适体K值为4.98mmol/L∞引。Cruz—Aguado等用荧光检测法对赭曲霉素在小麦样本中的检测限可以到达纳摩尔级旧3I,ELAA(酶联适体剖析)检测方法将检测限降低到1斗g/L,且2h便可对样本停止剖析Ⅲj。Wei等操作伏安法最低可检测到40ng/L的肉毒菌毒素旧5|。IDA方法可在1~100肛mol/L范围内检测氧四环素∞6|。Babkina等运用电流剖析法可以检测出水样和奶成品中0.1卜mol/L的Pb(II)、1.0trmol/L的Cd(II)以及0.1mmol/L的Fe(In)等重金属残留【37|。针对蒽环类抗生素的适体不只不变,且可以定量至8.4斗∥o38J。Song将卡那霉素的适体固定在胶体金颗粒上,最低检出限可达25i.Lmol/ml∞9|,此方法操纵简便,颜色变革用肉眼就能分辨。核酸适体的高分辨率使茶碱特异RNA适体对茶碱和咖啡因(与茶碱仅差1个甲基)的识别才华差10000倍㈣1,L-精氨酸的适体对识别D一精氨酸的才华更是相差12000倍‘41。。2.1.3抗运载蛋白Schlehuber运用噬菌体展示技术挑选到异羟基洋地黄毒苷的抗运载蛋白Di—gAl6'24|,其弼值可到达(2.00_+0.52)i山mol/LM2。,钻研发现它与靶标物质的联结位点夹在1个色氨酸和2个酪氨酸之间,这与异羟基洋地黄毒苷的单克隆抗体的联结位点很类似M3|。万方数据2.2扩充检测范围传统抗体是免疫系统针对大分子物质应激孕育发生的,但是有些小分子免疫原性低不能孕育发生抗体,或有些高毒性的小分子会使试验动物死亡,动物个体间的区别又使得每次制备出的抗体的亲和力和特异性有所差异,噬菌体展示技术将抗体、抗运载蛋白表达于噬菌体外表,实现非免疫性挑选,可以取得更宽泛的识别资料。而且抗运载蛋白的前体(Lipocalin)自身是运输小分子的蛋白,其分子骨架构像更合适与小分子物质联结埔1。2.3便于修饰和改造噬菌体展示技术实现了基因型和表型的统一,这使得基于此技术开展的单链抗体和抗运载蛋白等识别资料更便于修饰和改造。有钻研成果表白在对单链抗体停止改进时可以通过引入易错PCR和DNA改组等蛋白质定向进化技术停止突变和重组,进步亲和力并增多抗体的不变性ⅢJ,改造过的单链抗体亲和力以至比完好的抗体更高H5|。而适体是核酸片段,对其修饰利于适体的固相化和信号分子的标记H64’7J。Shi等建设了一个用芘标记的适体荧光探针检测了K+,其最低检测限能到达4.0x10。4moL/L[48]。2.4高效的检测技术本尝试室操作适体与靶标农药联结后构象扭转的原理建设了多种农药的核酸适体荧光检测技术阳2’49。5…。有钻研报导操作此原理检测赭曲霉毒素A,其核酸适体上标记有荧光基团,互补序列上标记有猝灭基团,当体系中没有待测物质时,序列互补,不孕育发生荧光信号,随着靶标物质浓度增多荧光信号加强,检测范围在1~100¨g/L,最低检测限可以到达0.8斗∥L,而且检测过程只必要1min”1|。基于生物特征识别资料开发的快捷检测技术还有荧光法、电化学法、芯片、纳米金标法等”2‘53|。3展望抗体库、SELEX技术和Anticalin制备技术的呈现,为制备高亲和力、高特异性的生物特征识别资料提供了可能性,按照其建设的生物传感器已应用于多种检测¨'54|。当前,以仪器法为根底的食品安详检测技术满足了大局部食品有毒有害物质的检测,但费用高且工夫长,不适于中国即采即售的果蔬产销方式,而传统抗体在识别小分子化合物上还存在王耘等:几种生物特征识别技术在食品有害小分子物质快捷检测中的应用213许多弊端。基于生物识别资料建设的检测平台相对术没有遍及使用自动化操纵,比较费时”9|。于传统的检测方法愈加倏地、易赐顾帮衬、检测限低且费抗运载蛋白的母体脂质运载蛋白,有以下几个用少,是一项应当大力推广的检测技术。长处,首先,其拓扑构造具有与抗体高级构造相似的单链抗体作为生物特征识别资料应用于食品安特征,都含有超变区和保守区的构造。6J,相对于抗全检测中有以下几个长处。首先,噬菌体展示技术为体来说它的4个环状高变区更容易在基因程度上操抗体工程带来的严峻停顿就是可以不经免疫动物大作,且可以通过定向突变进步亲和力瞄’17J。其次,量制备抗体,既省去制备单克隆抗体的细胞交融,又操作基因序列信息可以获取氨基酸序列,便于深刻制止了动物免疫的局限性;且该技术中噬菌体易于扩钻研它与小分子的识别作用,出格是在分子构造几增,可实现批量消费’5引。其次,操作噬菌体展示技术何学与氨基酸位点接触作用上,探究构造信息学规挑选简略易行,且耗时短,取得的抗体可以用于原核律,为计算机模拟技术定向设想识别分子提供实践系统表达,无需组织造就,极大地降低了老本惭J。再按照。再次,大大都天然的脂质运载蛋白是折叠的次,基于多轮挑选,单链抗体的灵活性和特异性较好,单体球蛋白,简直没有糖基化,更易于在细菌中重组并可以通过亲和力成熟的过程进步亲和力。不敷之表达,且整个蛋白质由一条小肽链组成,易于操纵和处是其挑选过程要基于靶标物质的固定,所以小分子大规模消费∞J,且比scFv愈加不变。基于脂质运载靶标物质在挑选前必要改造,使得试验过程比较繁蛋白的口袋型识别位点、分子接触面大、且骨架构造琐;并且相对于完好的IgG分子,噬菌体表达的Fab不变的特点,配体分子嵌人桶状模型后能造成高亲或scFv不太不变,且易造成聚合体一J。和力的不变型复合体,所以亲和力较高ⅢJ。但是就适体最大的长处首先在于核酸的不变性好,可目前的钻研来看,反抗运载蛋白在食品检测中应用以在较广的pH范围内保持活性。57J,更可以在高温的报导较少,还必要大力推广。后复性,重复使用,且保存期长并可以室温运输;其相对于制备传统抗体,这3种新的生物特征识次,停止体外扩增十分便当,构建的文库库容量大,别分子最重要的劣势是它们的制备愈加快捷、简便、实践上其多样性可以随随机序列的长度增多而增多低价,并且制止了动物免疫;可以操作它们制备有毒(48);再次,适体的特异性高,可以区分相近的物或低免疫原性的小分子识别物质;且它们一般都可质;最后,相对于抗体,适体的分子量更小,易于合成以人工合成,不会孕育发生批次间的误差。表1中比较和修饰H7|。但是核酸适体也有其局限性,如:RNA了它们与传统抗体的特性,可以看出操作新型生物适体容易被核酸酶降解b8【;普通的SELEX技术并特征识别资料检测食品中有毒有害的小分子物质有分歧适每种靶标物质的挑选;目前已报导的挑选技其特有的劣势…。表1生物特征识别资料的特性Table1Characteristicsofdifferentamnity-basedrecognitionelements当前,生物特征识别资料应用主要偏差于疾病完善。以上3种生物特征识别资料多是通过挑选技预防的诊断和治疗[24’觚2I,在食品有毒有害身分和术制备的,与传统抗体在制备上既有共性也有出格农兽药残留剖析中相对滞后。要充裕阐扬其在食品之处。通过操作多种高灵活度的分别办法,建设高安详检测领域中的劣势仍有很多障碍必要冲破,今效、快捷的制备技术是鞭策其应用的前提。(2)分后可以在如下几个方面展动工作。(1)制备技术的子改造技术的优化。亲和性是决定检测应用的关万方数据

导读:等.几种生物特征识别技术在食品有害小分子物质快捷检测中的应用[J].江苏农业学报,29(1):209-215.doi:10.3969/j.issn.1000-44,白红武1(1.江苏省食品质量安详重点尝试室——省部共建国家重点尝试室培育基地,农业部农产品质量安详控制技术与规范重点尝试室,江苏南京210095)摘要:食物中有毒有害小分子的检测方法不停是食品安详的钻研热,仪器法检测老本高、耗时长,